Ultrafiltrasyon Santrifüj Tüpleri İçin Deneysel Uygulamalar ve Sorun Giderme Çözümleri

Ultrafiltrasyon santrifüj tüpü laboratuvarda yaygın olarak kullanılan bir membran filtrasyon cihazıdır. Temel bileşeni, belirli bir moleküler ağırlık sınırına sahip bir ultrafiltrasyon membranıdır. Yaygın ultrafiltrasyon membran malzemeleri arasında polietersülfon (PES) ve rejenere selüloz (RC) bulunur. Ultrafiltrasyon santrifüj tüpünün çalışma prensibi, küçük molekülleri ultrafiltrasyon membranından geçirmek için santrifüj kuvveti ve moleküler-boyut{-tabanlı eleme kullanmak, böylece proteinler ve nükleik asitler gibi biyomakromoleküllerin hızlı konsantrasyonunu, tuzdan arındırılmasını, tampon değişimini veya saflaştırılmasını ve ayrılmasını mümkün kılmaktır.

 

MWCO Seçimi

Protein	Önerilen MWCO	Önerilen Santrifüj Süresi
6–20kDa	3kDa	40 dakika
20–30kDa	5kDa	30 dakika
30–60kDa	10kDa	20 dakika
60–100kDa	30kDa	20 dakika
100–200kDa	50kDa	15 dakika
200–600 kDa	100kDa	15 dakika
>600kDa	300kDa	15 dakika
Tek- veya Çift-İplikçik Nükleik Asit Molekülleri	Önerilen MWCO	Önerilen Santrifüj Süresi
137–1159 bp	30 kDa / 100 kDa	10 dk (sabit-açılı rotor, 5000 × g)
Nanoboncuklar	Önerilen MWCO	Önerilen Santrifüj Süresi
1,5–2 nm	3kDa	40 dakika
2–3 nm	5kDa	30 dakika
3–5 nm	10kDa	20 dakika
5–7 nm	30kDa	20 dakika
7–10 nm	50kDa	15 dakika
10–30 nm	100kDa	15 dakika
>30 deniz mili	300kDa	15 dakika

 

Proteinler için hedef proteinin moleküler ağırlığından 2-6 kat daha düşük bir membran MWCO seçilmesi önerilir. Akış hızı da dikkate alınırsa bu 2×–6× aralığının altında bir membran MWCO tavsiye edilir.

 

Uygulama Örneği (Döken Hücrelerden DNA)

Geleneksel yöntem için, 2,5 cm x 2 cm'lik bir gazlı bez parçası kesildi, küçük-hacimli bir sistemde parçalandı ve alet kullanılarak doğrudan saflaştırıldı. Konsantrasyon yöntemi için gazlı bez örnekleme alanı iki katına çıkarıldı. Lizis sonrasında sindirim süpernatantı 100 kDa'lık bir ultrafiltrasyon santrifüj tüpüne aktarıldı, 10.000 dev/dk'da santrifüjleme yoluyla konsantre edildi, ters santrifüjlemeyle geri kazanıldı ve daha sonra tam otomatik bir nükleik asit saflaştırma cihazı kullanılarak DNA ekstraksiyonuna tabi tutuldu. İki gruptaki başlangıç ​​hücre seviyelerinin esasen karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için elüsyon hacmi eşit şekilde 40 μL'ye ayarlandı.

 

Kantitatif testler, ortalama DNA konsantrasyonunun geleneksel yöntem için 0,099 ± 0,041 ng/μL ve konsantrasyon yöntemi için 0,193 ± 0,068 ng/μL olduğunu gösterdi. İki grup arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıydı (P < 0.01). Konsantrasyon yöntemiyle elde edilen toplam DNA verimi, geleneksel yöntemin 1,95 katıydı; bu, ultrafiltrasyon konsantrasyon adımının toplam DNA'da neredeyse hiç kayba neden olmadığını gösterdi. İki grubun Ct değerleri sırasıyla 27.64 ± 0.39 ve 27.58 ± 0.40 olup P > 0.01 idi; bu, ultrafiltrasyon tedavisinin PCR amplifikasyon inhibitörlerini devreye sokmadığını veya sonraki amplifikasyon reaksiyonlarına müdahale etmediğini gösterir.

 

STR genotiplemesi için, tam bir genotip, her lokustaki tam bantlar ve 200 RFU'dan büyük veya ona eşit bir ortalama tepe yüksekliği ile tanımlandı. 20 paralel örnek arasında, geleneksel yöntem yalnızca 14 örnek için tam genotipler verirken, konsantrasyon yöntemi 20 örneğin tamamı için tam STR genotiplemesi elde ederek eser temaslı örneklerin etkili genotipleme tespit oranını önemli ölçüde artırdı.

Kılavuz Teknolojisi ultrafiltrasyon santrifüj tüpleri, basit operasyon, yüksek konsantrasyon faktörleri ve yüksek numune geri kazanım oranlarına sahiptir ve biyokimya, moleküler biyoloji ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Guidling Teknolojisi ultrafiltrasyon santrifüj tüplerinin geri kazanım oranı, işlenen malzemeye bağlı olarak değişir ve genellikle %90'ı aşabilir.

 

Genel Sorun Giderme

Sorun	Olası Neden	Çözüm
Konsantrasyon sırasında yağış meydana gelir	Konsantrasyon çok hızlı	Santrifüj hızını azaltın
		Molekül ağırlığı daha yüksek olan bir ultrafiltrasyon tüpü kullanın
		Santrifüj tüpünde yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından tekrar santrifüjleyin
	Aşırı-konsantrasyon	Konsantrasyondan sonraki nihai protein konsantrasyonunun 20 mg/mL'yi geçmemesi önerilir.
Su filtrelenemez	Ultrafiltrasyon membranı tamamen kurudur ve membran yüzeyi zayıf bir şekilde hidrofobik hale gelir	Membranı düşük-yüzey-gerginlikli bir solventle ıslatın (örneğin, ilk santrifüjlemeyi su içinde %20 etanol ile gerçekleştirin)
Konsantrede hedef protein yok	Başlangıçtaki protein numunesi konsantrasyonu çok düşük (< 25 μg/mL)	Numune konsantrasyonu düşükse ve hacmi büyükse numuneyi tekrar tekrar yükleyin ve santrifüj edin.
	Yanlış membran MWCO seçimi	Membran MWCO'su genellikle hedef proteinin moleküler ağırlığının 2 katından az veya daha fazladır.
	Merkezkaç kuvveti belirtilen aralığın dışında	Önerilen merkezkaç kuvveti: 3000–5000 × g
	Hedef protein çökeldi	Konsantredeki hedef protein konsantrasyonunu ayarlayın (konsantrasyon faktörünü ayarlayın)
		Sıcaklığı ve pH'ı kontrol edin
		Katkı maddeleri kullanın
		İyonik gücü ayarlayın
Konsantre proteinin aşağı akış analizi sırasında girişim meydana gelir	Ultrafiltrasyon membranı eser miktarda gliserol içerir	Ultrafiltrasyon tüpünü-tampon ve saf suyla önceden durulayın. Parazit devam ederse 0,1 M NaOH ile temizleyin, ardından saf suyla durulayın ve döndürerek kurutun.
RNaz kirliliği	Ultrafiltrasyon tüpünün RNase-içermediği garanti edilmez	RNazı tamamen etkisiz hale getirmek için 2 saat boyunca 37 derecede %0,1 DEPC'de bekletilmesi önerilir; kalan DEPC arıtılmış suyla durulanarak çıkarılabilir
Endotoksin kontaminasyonu	Sağlanan ultrafiltrasyon tüpleri endotoksin-giderme işleminden geçmemiştir ve endotoksinler doğada yaygın olarak mevcuttur	Deneyden önce, 0,5 M NaOH ile-ön temizleme yapın, ardından endotoksinlerin çoğunu çıkarmak için saf suyla durulayın